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編號(hào) |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
5×雙酶一管式 RT-PCR Buffer |
200 μL（橘黃蓋） |
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試劑二 |
MMLV-Taq Mix |
75 μL（紅蓋） |
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試劑三 |
超純水 |
1 mL（亮黃蓋） |
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試劑四 |
人冠狀病毒OC43 RT-PCR 引物混合液 |
100 μL（白蓋） |
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試劑五 |
人冠狀病毒OC43 RT-PCR 陽性對(duì)照（1×10E8 /μL） |
50 μL（黃蓋） |
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試劑六 |
使用手冊(cè) |
1 份 |
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成份 |
N+2 個(gè) 樣品管 |
RT-PCR 陰性對(duì)照 |
RT-PCR 陽性對(duì)照 |
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5×雙酶一管式RT-PCR Buffer |
各 4 μL |
4 μL |
4 μL |
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人冠狀病毒OC43 RT-PCR 引物混合液 |
各 2 μL |
2μL |
2μL |
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N+2 個(gè)制備的 RNA 樣品 |
各 12.5μL |
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超純水 |
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12.5μL |
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人冠狀病毒OC43 RT-PCR 陽性對(duì)照的 1000倍稀釋液 |
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-- |
12.5μL |
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MMLV-Taq Mix |
1.5 μL |
1.5 μL |
1.5 μL |
4. 上機(jī)進(jìn)行 RT-PCR，RT-PCR 反應(yīng)參數(shù)為:
過程
溫度
時(shí)間
逆轉(zhuǎn)錄
42℃
30 min
預(yù)變性
95℃
5 min
PCR 反應(yīng)35個(gè)循環(huán)
95℃
30 sec
58℃
30 sec
72℃
20 sec
最后延伸
72℃
7 min
三、電泳檢測(cè)：
5. 瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。如果陰性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物或陽性對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物，則說明實(shí)驗(yàn)失敗，需要分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因。只有在陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物、陽性對(duì)照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn)，才有必要分析樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果有預(yù)期片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物則為陽性，如果無則為陰性。