分裂、傳代和亞培養(yǎng)都是維持健康細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的重要過程。本文將為您提供有關(guān)如何傳代細(xì)胞、傳代細(xì)胞步驟以及可能出現(xiàn)的問題的詳細(xì)指出。

  粘附與懸浮

  在深入研究如何傳代細(xì)胞之前，我們需要解釋一下粘附細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的區(qū)別。

  貼壁細(xì)胞附著在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿的表面。這意味著它們的生長受到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶表面面積的限制。這也意味著需要先將它們分離，然后才能將它們重新接種到新的培養(yǎng)皿中。

  細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶通常會經(jīng)過涂層處理，以幫助促進(jìn)細(xì)胞附著在表面。

  懸浮細(xì)胞不附著，而是自由漂浮在培養(yǎng)基中。因此，它們的生長不受表面積的限制，而是受培養(yǎng)物中細(xì)胞密度的限制。懸浮細(xì)胞需要攪拌以確保最佳生長和氣體交換，通常在旋轉(zhuǎn)瓶或搖動培養(yǎng)箱中生長。

  由于懸浮細(xì)胞不需要從培養(yǎng)瓶中分離出來，因此它們被認(rèn)為更易于傳代。

  表1.懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的比較:

  貼壁細(xì)胞傳代

  您已檢查細(xì)胞培養(yǎng)物的融合度，并且它們已準(zhǔn)備好傳代。接下來該做什么？傳代貼壁細(xì)胞主要有四個步驟：

•   1、PBS洗滌
•   2、消化/解離
•   3、終止消化
•   4、接種

  一、PBS洗滌

  在從培養(yǎng)皿中分離細(xì)胞之前，重要的是吸出舊的、用過的培養(yǎng)基并用平衡鹽溶液(BSS)沖洗細(xì)胞。

  為什么需要沖洗貼壁細(xì)胞？

  沖洗細(xì)胞將有助于消除培養(yǎng)基中可能抑制細(xì)胞釋放溶液作用的蛋白質(zhì)和離子。使用BSS是因為它們能保持生理pH值和鹽濃度。

  典型的鹽溶液包括：

  ·磷酸鹽緩沖溶液(PBS)

  ·漢克斯緩沖鹽溶液(HBSS)

  ·Earle平衡鹽溶液(EBSS)

  在傳代培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用不含鈣和鎂的鹽溶液，因為鈣和鎂都會促進(jìn)細(xì)胞聚集。

  二、消化/解離

  通過破壞細(xì)胞蛋白與培養(yǎng)皿表面的相互作用，細(xì)胞可以從培養(yǎng)皿中釋放出來。不同類型的細(xì)胞在粘附培養(yǎng)皿底部方面具有不同的特性。一些細(xì)胞仍然像小球一樣，幾乎不與培養(yǎng)皿接觸，而另一些細(xì)胞則平鋪并覆蓋多層蛋白質(zhì)，將它們與培養(yǎng)皿結(jié)合在一起。

  您的目標(biāo)是使用對每種細(xì)胞類型損傷最小的程序?qū)⒓?xì)胞從培養(yǎng)皿中分離出來。您選擇如何將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中釋放出來將取決于細(xì)胞的粘附特性。

  選擇1：機(jī)械分離

  一些輕度粘附的細(xì)胞在加入BSS（不含鈣和鎂）后會開始從培養(yǎng)皿中升起。在這種情況下，只需將BSS直接噴灑在細(xì)胞上并輕敲培養(yǎng)皿即可去除細(xì)胞。

  也可以用細(xì)胞刮刀輕輕去除松散附著的細(xì)胞。

  選擇2：EDTA

  EDTA是一種螯合劑，可以結(jié)合整合素維持細(xì)胞粘附所需的Ca 2+離子。EDTA（1-10mM，取決于細(xì)胞類型）是將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中分離出來的較溫和的方法之一，但僅使用EDTA對大多數(shù)細(xì)胞類型來說不夠有效。

  EDTA在預(yù)熱至37°C時最有效，但對于非常敏感的細(xì)胞，請使用室溫或4°C的EDTA。

  選擇3：酶促釋放

  蛋白水解酶可用于消化粘附細(xì)胞到培養(yǎng)皿的蛋白質(zhì)。此選項對于傳遞牢固附著的粘附細(xì)胞是必需的，因此通常用于傳遞粘附細(xì)胞。

  然而，需要謹(jǐn)慎，因為蛋白水解消化可能會通過切割細(xì)胞表面蛋白來破壞細(xì)胞的完整性。治療時間應(yīng)限制在剛好達(dá)到細(xì)胞分離所需的時間范圍內(nèi)，以防止細(xì)胞損傷。

  對于處理細(xì)胞的時間長短沒有硬性規(guī)定。處理時間需要根據(jù)每種細(xì)胞類型根據(jù)經(jīng)驗確定，取決于細(xì)胞粘附的強(qiáng)度、細(xì)胞培養(yǎng)的時間長度以及培養(yǎng)物的匯合度。

  胰蛋白酶是用于傳代細(xì)胞的最常用酶。胰蛋白酶在賴氨酸或精氨酸殘基后進(jìn)行切割，而脯氨酸不會緊隨其后。工作胰蛋白酶濃度范圍為0.025%至0.5%，胰蛋白酶溶液通常用EDTA制成，以增強(qiáng)細(xì)胞分離。

  3.分離和滅活

  為了防止細(xì)胞結(jié)塊和分布不均，細(xì)胞應(yīng)處于單細(xì)胞懸浮狀態(tài)。如果不是，向細(xì)胞中添加少量液體，然后輕輕地將液體移入和移出5毫升移液器。

  有些實驗室會添加加熱的生長培養(yǎng)基，而有些實驗室會添加含有10%胎牛血清(FBS)的BSS。添加加熱的生長培養(yǎng)基或BSS+FBS可使用于從培養(yǎng)皿中分離細(xì)胞的試劑失活，并提供更多體積用于移液。

  為了完全滅活分離劑，請將細(xì)胞收集到大量生長培養(yǎng)基或BSS+FBS中，然后離心細(xì)胞。如果將細(xì)胞稀釋到大量生長培養(yǎng)基中以便重新接種，并且殘留的胰蛋白酶/EDTA不會影響細(xì)胞附著，則可以省略離心步驟。

  4、接種

  當(dāng)細(xì)胞從培養(yǎng)皿中脫落或處于離心機(jī)中時，我通常會設(shè)置要將細(xì)胞移入的培養(yǎng)皿，標(biāo)記所需數(shù)量的培養(yǎng)皿，并將加熱的生長培養(yǎng)基添加到培養(yǎng)皿中。

  細(xì)胞分離后，將離心后的細(xì)胞重新懸浮在少量生長培養(yǎng)基中，并使用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)細(xì)胞。將細(xì)胞稀釋至適當(dāng)密度，然后分裝到新培養(yǎng)皿中。我喜歡添加足夠的培養(yǎng)基，將1-2毫升移液到每個接收培養(yǎng)皿中。輕輕旋轉(zhuǎn)和搖動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分散在整個培養(yǎng)皿中。

  如何傳代懸浮細(xì)胞

  一些細(xì)胞，例如我們血液中的造血細(xì)胞，自然地懸浮在體液中，不會附著在表面。

  培養(yǎng)這些懸浮細(xì)胞比培養(yǎng)貼壁細(xì)胞要容易一些，因為懸浮細(xì)胞不需要胰蛋白酶消化，因為它們已經(jīng)是自由漂浮的。因此，傳代過程更快，對細(xì)胞的壓力更小。

  確定懸浮細(xì)胞的傳代時間

  懸浮細(xì)胞通常保存在培養(yǎng)瓶中，每2或3天達(dá)到匯合時重新接種。您可以判斷懸浮細(xì)胞何時達(dá)到匯合，因為它們會開始聚集在一起并漂浮在培養(yǎng)基上；培養(yǎng)基會略微改變顏色并顯得更渾濁。

  懸浮細(xì)胞傳代涉及兩個主要步驟：

•   1.計數(shù)
•   2.稀釋

  然而，如果細(xì)胞已達(dá)到高密度且培養(yǎng)基變酸，您可能希望通過添加離心步驟去除舊培養(yǎng)基。

  在分離細(xì)胞之前，您應(yīng)該在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)物。健康生長的懸浮細(xì)胞應(yīng)呈圓形且明亮，細(xì)胞碎片最少。通過觀察顏色來檢查培養(yǎng)基是否呈酸性：當(dāng)pH值為酸性時，酚紅會變黃，這表明培養(yǎng)物中的細(xì)胞過多。

  1.計數(shù)細(xì)胞

  懸浮細(xì)胞通常保存在培養(yǎng)瓶中，每2或3天達(dá)到匯合時重新接種。如果您正在準(zhǔn)備用于實驗的培養(yǎng)瓶，您可能需要先計算細(xì)胞數(shù)量，以確保您在培養(yǎng)瓶中接種了適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。

  計數(shù)懸浮細(xì)胞與計數(shù)粘附細(xì)胞相同（在它們分離并重新懸浮之后）。但是，為了確保粘附細(xì)胞的計數(shù)準(zhǔn)確，請在取樣計數(shù)之前輕輕移液培養(yǎng)物，以確保培養(yǎng)物分布均勻。

  如果您正在分裂細(xì)胞以進(jìn)行維護(hù)，則可以跳過計數(shù)步驟。

  2.稀釋細(xì)胞

  對于懸浮細(xì)胞，并不需要像貼壁細(xì)胞那樣真正去除所有舊培養(yǎng)基。相反，可以去除部分舊培養(yǎng)物，然后用新鮮培養(yǎng)基將剩余的培養(yǎng)物稀釋到合適的細(xì)胞密度。

  或者，可以從舊燒瓶中取出一部分細(xì)胞并稀釋到新鮮培養(yǎng)基中。

  但是，當(dāng)您的培養(yǎng)物呈酸性時，建議移除培養(yǎng)基。要移除舊培養(yǎng)基，請以150xg離心5分鐘，移除酸性培養(yǎng)基，輕輕地將細(xì)胞沉淀懸浮在溫?zé)崤囵B(yǎng)基中，然后重新接種到新鮮培養(yǎng)基中。

  細(xì)胞培養(yǎng)傳代技巧

  1.使用前將所有試劑放入37°C水浴中預(yù)熱約30分鐘。這將有助于保持細(xì)胞健康并避免溫度變化帶來的沖擊。

  2.在開始之前設(shè)置組織培養(yǎng)罩，確保罩是干凈的，并且您擁有所需的所有設(shè)備。這可以縮短傳代細(xì)胞所需的時間，并減少因離開培養(yǎng)罩/培養(yǎng)室而造成的潛在污染。

  3.在組織培養(yǎng)罩內(nèi)設(shè)立不同的“潔凈區(qū)”和“臟區(qū)”，并合理設(shè)置它們，這樣您就不會將臟設(shè)備放在“潔凈區(qū)”內(nèi)。

  4.確保始終使用無菌技術(shù)，以盡量減少細(xì)胞的潛在污染。將試劑從水浴中取出后，不要忘記擦拭試劑，并在將其放入通風(fēng)柜前用70%乙醇或IMS噴灑試劑。

  5.僅使用少量胰蛋白酶釋放細(xì)胞（1-2ml/25cm2），并將胰蛋白酶時間保持在釋放細(xì)胞所需的最短時間（當(dāng)細(xì)胞剛剛檢測到時）。用力“拍打”培養(yǎng)皿和燒瓶，以幫助在胰蛋白酶消化后釋放細(xì)胞。

  6.胰蛋白酶化后，向胰蛋白酶和細(xì)胞中添加少量加熱的生長培養(yǎng)基，然后用5毫升移液器反復(fù)將液體移入和移出，以打碎任何細(xì)胞團(tuán)塊。

  7.重新接種細(xì)胞（特別是貼壁細(xì)胞）時，輕輕搖晃/旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板以確保細(xì)胞分布均勻。詳情見下圖1。

  如何傳代細(xì)胞：接種后獲得均勻分布的細(xì)胞。

  圖1.接種后如何使細(xì)胞分布均勻。

  8.開始前預(yù)先標(biāo)記培養(yǎng)板，并在細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化時添加溫?zé)崤囵B(yǎng)基。這可以最大限度地縮短細(xì)胞離開培養(yǎng)箱的時間，從而限制環(huán)境沖擊和干擾的程度。

  9.以1:2至1:10之間的稀釋比例分批細(xì)胞。稀釋比例過高，細(xì)胞很快就會變得過于擁擠；稀釋比例過低，細(xì)胞可能因密度低而無法存活。（細(xì)胞也會感到孤獨(dú)?。?/span>

  10.為細(xì)胞分裂制定一個時間表（例如，在星期二和星期五）。制定時間表將使你更容易記住傳代培養(yǎng)物，避免細(xì)胞過度融合。

  11.整理好培養(yǎng)箱，這樣你就能確切地知道哪些細(xì)胞在哪里。這可以減少你尋找培養(yǎng)物的時間。長時間打開培養(yǎng)箱門可能會改變環(huán)境，影響細(xì)胞的生長和正在進(jìn)行的實驗。

  好了，上述是細(xì)胞傳代概述，無論你培養(yǎng)哪種細(xì)胞類型，分裂細(xì)胞時都應(yīng)準(zhǔn)確、無菌且快速，以盡量減少污染和對培養(yǎng)物的壓力。做好準(zhǔn)備和組織起來也有助于縮短分裂細(xì)胞所需的時間。